Es endémico de la corriente de Humboldt; nidifica en la costa occidental de América del Sur, desde Perú hasta Chiloé, Chile.
Esta especie se alimenta principalmente de peces, siendo los cefalópodos y crustáceos alimentos secundarios. Las especies de peces consumidas varían según la latitud.

Habita formando colonias en las puntas e islas protegidas del litoral, junto con otras especies de aves guaneras. Para anidar excavan agujeros en el guano o la tierra salitrosa, o utilizan grietas existentes entre las rocas y cuevas naturales. Uno de los problemas detectados por los investigadores es que, al extraer el guano de la superficie de las islas, los pingüinos se veían impedidos de excavar en la dura roca, limitando de manera significativa sus posibilidades de reproducción. Los pingüinos ponen dos huevos de diferente tamaño, los que son incubados por ambos padres durante aproximadamente 35 días. Por lo general, sólo el primer polluelo sobrevive. Los pichones son protegidos en el nido hasta que cumplen 20 días de nacidos, luego se unen con las crías de otros pingüinos para formar grandes guarderías, mientras los padres salen al mar a alimentarse. Ambos progenitores continúan alimentando a sus polluelos durante dos meses y medio.

Su población en el Perú está calculada en unos 13 000 ejemplares. Entre las medidas de conservación realizadas por distintos organismos está la construcción de nidos artificiales y la creación de zonas intangibles que protejan a colonias bien identificadas. Es importante reducir las muertes por ahogo en redes agalleras y la depredación por parte del hombre y sus animales. Es una especie considerada amenazada de extinción.
El pingüino de Humboldt está en peligro de extinción. Pese a ser materia de interés y estudio por parte de investigadores, es continuamente perseguido por sus cualidades gastronómicas. Los polluelos son buscados también para ser utilizados como mascotas domésticas.
En 1992 la EAZA estableció un programa EEP con el que se pretende salvar un 90% de su diversidad genética en 100 años.
Chile cuenta con las mayores colonias de esta especie a nivel mundial.

El monumento natural Islotes de Puñihuil, en la Región de Los Lagos, es uno de los pocos lugares conocido en el que los pingüinos de Humboldt y magallánicos comparten la misma colonia reproductiva.
Un importante lugar de nidificación se encuentra en el islote Pájaro Niño, en Algarrobo. Este lugar se encuentra protegido desde 1995. El noticiero de TVN realizó una denuncia el 13 de enero de 2013, al mostrar en una nota que la Cofradía Náutica de Algarrobo realizaba la destrucción de huevos de este pingüino.
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